抗体开发需要多长时间？

收到第一批上清液形式的抗体（条件培养基中的分泌型抗体）通常需要三个月左右的时间，这些抗体将根据使用免疫原通过ELISA 的筛选方案以1 mL至2 mL等分的形式交付。客户将使用上清液验证抗体，并选择杂交瘤群体进行有限稀释和克隆群体扩增。一旦杂交瘤细胞株准备好，客户就可以决定是否在自己的实验室用克隆生产抗体，或者 ProMab 可以利用培养基或通过腹水进行大规模生产。

客户能得到哪些阳性克隆？

我们不可能对抗体的所有应用进行测试，但我们保证至少有 10 个阳性克隆是利用客户提供的抗原进行 ELISA 检测的。如果客户需要进行其他筛选检测，以验证抗体的特定应用，如 Western、IHC 或流式细胞术，请联系客服。

客户会收到克隆杂交瘤细胞系吗？

在每个项目结束时，我们会将亚克隆，克隆细胞系以冷冻或活培养的形式寄给您。冻存细胞系（2-3瓶，除非要求更多数量）将在液氮中保存 6 个月，不收取额外费用。如果客户要求细胞系的储存时间超过 6 个月，则需要支付象征性的额外费用。

用什么抗原制造抗体？

远泰生物（ProMab） 的免疫方案可适用于天然蛋白、重组蛋白、藕联多肽及藕联小分子。如果合成肽小于 8 kDa，则需要通过增加半胱氨酸残基的巯基与载体分子 KLH偶联。一般来说，与较大的重组蛋白或蛋白片段相比，肽抗原在引起强烈免疫反应方面的成功率较低。不过，多肽抗原的优点是可以经过精心设计，避开与同一蛋白家族其他成员相似或相同的序列区域，因此可能更具特异性。

抗体开发需要多少抗原？

如果抗原是多肽，一般需要 5 毫克游离多肽和 5 毫克共轭多肽就足够了。如果多肽高度纯化，所需用量可能更少。如果抗原是蛋白质，3-5 毫克（浓度为 0.5-1 毫克/毫升）一般就足够了。请务必告知我们使用的缓冲液和蛋白质浓度。亲和纯化抗体时，需要 5 毫克可溶性蛋白来制备免疫亲和柱。

如何检测你们开发的抗体？

根据客户的抗体应用要求，通过 ELISA、Western 、 IHC 、 ICC 对抗体进行检测。所有 ProMab 抗体都经过了广泛的测试。根据客户要求，我们还使用非传统检测方法对抗体进行检测，包括免疫沉淀和流式细胞术。

如何测量抗体滴度？

抗体滴度通过 ELISA 法测定。在这种方法中，我们在 96 孔板上涂抹抗原，然后反复清洗以去除未结合的抗原。在与抗原结合的孔中加入抗体的系列稀释液，反复清洗以去除未结合的抗体。然后加入标记的二抗，用比色法测定结合一抗的量。

如何储存抗体？

冻干抗体的储存：我们的所有产品都是冻干的。这种形式的抗体在环境温度下可长期稳定保存而不会降低质量。在 40˚C 下可保存数年。加水复溶后，储存条件取决于抗体的类型，如下所述。

腹水： 重组腹水时，加入少量叠氮化物或硫柳汞以防止微生物生长。腹水应冷冻保存。单克隆抗体通常不会因冻融而失去明显的活性，但建议分装以避免重复冻融。不建议在 4˚C 下长期保存！与血清不同，腹水可能含有蛋白酶，最终会降解抗体。加入蛋白酶抑制剂可能有助于减缓降解。

纯化的 IgG：除非添加 BSA 等载体蛋白，否则不要储存稀释的（<0.1mg/ml）抗体溶液。IgG 和其他蛋白质一样，会与玻璃和塑料发生非特异性结合。任何低于 0.1 mg/ml 蛋白质的 IgG 溶液都会粘附在储存容器上并变性，从而失去活性。反复冻融稀释纯化的 IgG 几乎肯定会导致大量损失。

兔血清： 血清中的抗体比腹水中的抗体更稳定。使用抗微生物添加剂后，可将其储存在 4˚C 温度下（血清不含明显的蛋白酶活性；事实上，血清本身就含有强大的鸡尾酒蛋白酶抑制剂）。不过，冷冻保存的时间更长（数月至数年）。

多克隆亲和纯化抗体： 由于蛋白酶抑制剂和载体蛋白在纯化过程中被去除，纯化抗体在血清中稳定性不如腹水。因此，不建议在 4˚C 下长期保存（如数周）。

抗体的滴度和工作稀释度有什么区别？

抗体滴度是指抗体在特定系统中仍然有效的最低浓度（最高稀释度）。工作稀释度通常是指能够提供高灵敏度和高信噪比的浓度。使用过高的浓度会造成浪费，并可能产生非特异性信号。另一方面，浓度过低会导致灵敏度下降。

如何用 280nm 波长的吸光度确定抗体浓度？

抗体量可通过 280nm 波长处的吸光度确定。1 OD = 约 0.75 mg/ml 纯化抗体。

在免疫学技术中，用什么来阻断非特异性结合？

这主要取决于所用抗体的类型。对于大多数 ELISA 和 Western 应用，2% 脱脂牛奶是一种很好的阻断剂。另外，3% 牛血清白蛋白有时也很有效。明胶或血清（非一抗种类）也可用于阻断非特异性结合。

什么是单特异性反应？

单特异性抗体是指只与单一抗原决定因子发生反应的抗体。单克隆抗体是唯一真正的单特异性试剂。不过，该术语也用于描述针对肽抗原培养和亲和纯化的多克隆抗体。

线性表位与构象表位有何区别？

线性表位由蛋白质分子上可被抗体识别的约 6 到 10 个相邻氨基酸组成。相反，构象表位由不按顺序排列的氨基酸组成。在这种情况下，抗体只能识别抗原的三维结构。当蛋白质分子折叠成三维结构时，形成表位的氨基酸会并列在一起，从而使抗体能够识别序列。了解线性表位或构象表位之间的差异在免疫学应用中意义重大。在变性蛋白质中，只有线性表位可以被识别。因此，在使用变性蛋白质的方案中，如在 Western 印迹法中，首选能识别线性表位的抗体。有时，表位在蛋白质内部，相对于其原生构象而言。在非变性方案（如非变性免疫沉淀）中，抗体无法识别该表位。根据定义，构象表位必须位于折叠蛋白质的外部。能识别构象表位的抗体适用于温和的非变性程序，如非变性免疫沉淀或流式细胞仪。最理想的情况是，能识别正常折叠蛋白质表面线性表位的抗体在非变性和变性程序中都能很好地发挥作用。

收到 CAR-T 细胞需要多长时间？

一般来说，我们所有现成的 CAR-T 细胞都有充足的库存，收到付款或订单后即可发货。但是，如果我们没有库存，则大约需要 2-3 周才能收到产品。

涉及哪些质量控制？

不可能对每一种应用都进行检测，但所有 CAR-T 细胞都可以通过多种方式进行验证，例如：检测转导效率（通过流式细胞仪检测 Fab Ab）、细胞杀伤活性：IL-2、IFN-γ 检测；以及实时细胞毒性活性 (RTCA)。

从数百万个细胞中能给我带来什么？

您将获得经 CAR 转导的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的异源组合。

这些细胞能否像其他悬浮培养物一样进行培养和传代？

CAR-T 细胞是完全活化和扩增的原代人类 T 细胞。因此，它们在培养过程中不会再扩增，也不能进一步扩增。这些细胞解冻后可立即用于检测。因此，建议您在解冻细胞前做好实验准备。

我可以扩增这些细胞并冷冻一些储备以供将来使用吗？

这些 CAR-T 细胞已被含有嵌合抗原受体盒的慢病毒转导，并已完全激活和扩增。因此，它们不能再进一步扩增。

解冻细胞时，细胞存活率很低。这是怎么回事？

我们的 CAR-T 细胞在包装时略有超量，以弥补冻融过程中的损失。请参考我们的解冻方案。

我有一个 scFv 序列，想制作成 CAR-T 细胞。你们提供定制开发吗？

可以！您可以利用我们的专业知识，我们可以为您开发 CAR-T 细胞。请联系客服了解更多详情。

你们是否出售适用于CAR-T细胞的细胞培养基和补充剂？

PM-CAR2000 CAR-T 细胞扩增培养基（人血清），500 ML，899 美元

PM-CAR2001 CAR-T 细胞培养基（胎牛血清），500 ML，599 美元

PM-CAR2002 CD28/CD3 PM-T 细胞活化/扩增珠，2 ML，499 美元

为什么在 Western Blotting中看到的信号很弱或没有信号？

有几种可能的原因。在某些情况下，抗体可能识别了在自然条件下无法检测到的构象表位。可以用ELISA、免疫沉淀法或其他适当的免疫化学方法来确认抗体的完整性。在其他情况下，抗体的亲和力可能较低。在这种情况下，可以增加孵育时间和一抗浓度。信号弱也可能是抗原从凝胶转移到膜的效率不高造成的。这是由于接触不充分造成的，原因是凝胶和膜之间存在气泡，或凝胶或缓冲液中 SDS 过量。

Western Blotting上有太多条带？

与理论预测相反，检测到多条条带的情况并不少见。虽然可能是抗体对蛋白质不完全特异，但也可能是其他因素造成的：

抗原的蛋白分解：这种情况并不少见，尤其是在样本存放时间较长或起始组织匀浆后蛋白质或膜被分馏的情况下。所有额外条带的表观分子质都低于全长蛋白。特别易受影响的是突触素和突触肽。应考虑添加蛋白酶抑制剂，如 PMSF、epstatin 或 leupeptin。有几家供应商为此提供蛋白酶鸡尾酒试剂。当然，也有可能部分蛋白质在提取前已经降解，在这种情况下就无法去除这些产物。

变性和/或还原不足：如果样品缓冲液中没有足够的 SDS 和/或还原剂（DTT、2-巯基乙醇），蛋白质可能无法完全解离成亚基、还原或变性。因此，凝胶上所需蛋白质的上方可能会出现额外的条带。上样前立即将样品放入样品缓冲液中煮沸可减少这些非共价相互作用或二硫键。使用 TCEP 等不可逆还原剂代替 DTT 或 beta-巯基乙醇也会有所帮助。

每条带蛋白质过多或检测系统过于灵敏：凝胶负荷过重是产生 “鬼带 ”最常见原因之一。固定化蛋白质可能会提供一个浓缩的吸附表面，某些 IgG 可能会与之发生非特异性结合。同样，在使用增强化学发光等高灵敏度检测系统时，也可能会发现这种非特异性结合。利用起始材料的稀释队列通常可以检查哪些信号是伪造的。

无效阻断：文献中描述了多种不同的阻断剂，包括非离子洗涤剂和/或蛋白质。改变阻断条件可以解决问题。

抗原浓度太低：SDS-PAGE 的分辨率仅限于 50-100 条带。如果目的抗原的相对浓度过低（低于蛋白质总量的 0.2%），则可能难以检测（例如，突触素/VAMP 与细胞匀浆中的组蛋白结合，从而干扰其检测）。信号增强可能会导致出现不真实的条带。应考虑通过分馏或免疫沉淀来富集抗原。

不必要的特异性反应：抗体，尤其是多克隆抗体，有时会识别生物样本中与抗原序列相似的蛋白质，如同一蛋白质家族中的蛋白质。非亲和纯化的多克隆抗体通常会识别其他条带，这是因为动物在一生中会接触到各种其他蛋白质。这可以通过利用免疫前血清并将其用作对照来解决。

为什么目标条带的分子量低于文献报道的分子量？

据报道，P53 蛋白最初发现时的分子量为 53KD。现在已知它是一种 43.7 KD的蛋白质。造成这一差异的原因是蛋白质中含有大量脯氨酸残基，这些残基会减缓蛋白质在 SDS-PAGE上的迁移速度，从而使蛋白质看起来比实际重量更重。

为什么我在 IHC 中观察到多个组织成分出现弥漫性染色或中度至重度染色？

当标本固定时间过长时，由于醛交联和组织疏水性增加，导致抗原决定因素被掩盖，从而出现弥漫性染色。使用胰蛋白酶或其他蛋白水解酶会破坏交联，使某些组织抗原发生反应。在其他情况下，切片可能太厚，或标本可能含有破碎或坏死的成分。这会导致假阴性染色，同时伴有强烈的背景染色。另一方面，使用稀释不足的一抗也会导致标本或阳性对照出现强烈染色。

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